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商品化脱水合成培养基配制使用注意事项

发布时间:2019-10-18    浏览次数:128

1. 一般要求

正确制备培养基是微生物检验的最基础步骤之一,使用脱水培养基和其他成分,尤其是含有有毒物质(如胆盐或其他选择剂)的成分时,应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。培养基的不正确制备会导致培养基出现质量问题,如含琼脂培养基不凝固、ph不在要求范围、灭菌后颜色变深等。

使用商品化脱水合成培养基制备培养基时,应严格按照厂商提供的使用说明配制。如重量(体积)、pH、制备日期、灭菌条件和操作步骤等。 实验室使用各种基础成分制备培养基时,应按照配方准确配制,并记录相关信息,如:培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积(分装体积)、无菌措施(包括实施的方式、温度及时间)、配置日期、人员等,以便溯源。

2. 水

实验用水的电导率在25℃时不应超过25 μS/cm(相当于电阻率≥0.4 ΜΩcm),除非另有规定要求。 水的微生物污染不应超过103 CFU/mL。应按GB 4789.2,采用平板计数琼脂培养基,在36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h进行定期检查微生物污染。

3.培养基称重和溶解

小心称量所需量的脱水合成培养基(必要时佩戴口罩或在通风柜中操作,以防吸入含有有毒物质的培养基粉末),先加入适量的水,充分混合(注意避免培养基结块),然后加水至所需的量后适当加热,并重复或连续搅拌使其快速分散,必要时应完全溶解。含琼脂的培养基在加热前应浸泡几分钟。

4. 培养基pH 的测定和调整

用pH计测pH,必要时在灭菌前进行调整,除特殊说明外,培养基灭菌后冷却至25 ℃时,pH应在标准pH±0.2范围内。一般使用浓度约为40 g/L(约1 mol/L)的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L(约1 mol/L)的盐酸溶液调整培养基的pH。如需灭菌后进行调整,则使用灭菌或除菌的溶液。

5. 培养基分装

将配好的培养基分装到适当的容器中,容器的体积应比培养基体积最少大20%。

6. 培养基灭菌

培养基应采用湿热灭菌法或过滤除菌法。某些培养基不能或不需要高压灭菌,可采用煮沸灭菌,如SC肉汤等特定的培养基中含有对光和热敏感的物质,煮沸后应迅速冷却,避光保存;有些试剂则不需灭菌,可直接使用。

湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行,高压灭菌一般采用121℃±3℃灭菌15min,具体培养基按食品微生物学检验标准中的规定进行灭菌。培养基体积不应超过1000mL,否则灭菌时可能会造成过度加热。所有的操作应按照标准或使用说明的规定进行。灭菌效果的控制是关键问题。加热后采用适当的方式冷却,以防加热过度。这对于大容量和敏感培养基十分重要,例如含有煌绿的培养基。培养基十分重要,例如含有煌绿的培养基。

过滤除菌可在真空或加压的条件下进行。使用孔径为0.2 μm的无菌设备和滤膜。消毒过滤设备的 各个部分或使用预先消毒的设备。一些滤膜上附着有蛋白质或其他物质(如抗生素),为了达到有效过滤,应事先将滤膜用无菌水润湿。

检查 对经湿热灭菌或过滤除菌的培养基进行检查,尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行检查。

7. 培养基的使用

7.1 琼脂培养基的融化

将琼脂培养基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法(如高压锅中的层流蒸汽)使之融化。经过高压的琼脂培养基应尽量减少重新加热时间,融化后避免过度加热。融化后应短暂置于室温中(如2 min)以避免玻璃瓶破碎。

融化后的培养基放入47℃~50℃的恒温水浴锅中冷却保温(可根据实际培养基凝固温度适当提高水浴锅温度),直至使用,培养基达到47℃~50℃的时间与培养基的品种、体积、数量有关。融化后的培养基应尽快使用,放置时间一般不应超过4 h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培养基尤应注意,融化后保温时间应尽量缩短,如有特定要求可参考指定的标准。倾注到样品中的琼脂培养基温度应控制在约45℃左右。

7.2 培养基的脱氧

必要时,将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加热15 min;加热时松开容器的盖子;加热后盖紧,并迅速冷却至使用温度(如FT培养基)。

7.3 添加成分的加入

对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃~50℃时再加入。无菌的添加成分在加入前应先放置到室温,避免冷的液体造成琼脂凝结或形成片状物。将加入添加成分的培养基缓慢充分混匀,尽快分装到待用的容器中。

7.4 平板的制备和储存

倾注融化的培养基到平皿中,使之在平皿中形成厚度至少为3 mm(直径90mm的平皿,通常要加入18mL~20mL琼脂培养基)。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。如果平板需储存,或者培养时间超过48h或培养温度高于40℃,则需要倾注更多的培养基。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和(或)5℃±3℃冰箱的密封袋中,以防止培养基成分的改变。在平板底部或侧边做好标记,标记的内容包括名称、制备日期和(或)有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。

将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生,平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对培养基表面进行干燥处理。对于采用表面接种形式培养的固体培养基,应先对琼脂表面进行干燥:揭开平皿盖,将平板倒扣于烘箱或培养箱中(温度设为25℃~50℃);或放在有对流的无菌净化台中,直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。

8. 培养基的弃置

所有污染和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式,并且要符合相关法律法规的规定。

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